一、目的与要求：1、掌握2．6-二氯酚靛酚测定维生毒C的原理和方法。二、原理：还原型抗坏血酸能还原染料2.6-二氯酚靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2.6-二氯酚靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准2.6-二氯酚靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。三、试剂：(1)2％草酸溶液：溶解20克草酸结晶于200毫升水中，然后稀释至1000ml。(2)1％草酸溶液：取上述2％草酸溶液500ml，用水稀释至1000m1。(3)抗坏血酸标准溶液：准确称取20mg抗坏血酸，溶于1％草酸溶液中，移入lOml量瓶中，并用1％草酸溶液稀释至100毫升，混匀，置冰箱中保存。使用时吸取上述抗坏血酸5ml，置于50毫升容量瓶中，用1％草酸溶液定容之。此标准使用液每毫升含0.02mg维生素C。标定：吸取标准使用液5m1于三角烧瓶中，加入6％碘化钾溶液0.5ml，1％淀粉溶液3滴，再以0.001N碘酸钾标准溶液滴定，终点为淡蓝色。计算如下：抗坏血酸浓度（mg/ml）=(V1×0.088)/V2式中：V1——滴定时所耗0.001N碘酸钾标准溶液的量(ml)V2——所取抗坏血酸的量(ml)0.088——lmlO.0001N碘酸钾标准溶液相当于抗坏血酸的量(mg／m1)(4)2.6：二氯靛酚溶液：称取碳酸氢钠52mg，溶于200ml沸水中，然后称取2.6-二氯靛酚50mg，溶解在上述碳酸氢钠的溶液中，待冷，置于冰箱中过夜，次日过滤置于250ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。此液应贮于棕色瓶中并冷藏，每星期至少标定1次。标定方法：取5m1已知浓度的抗坏血酸标准溶液，加入1％草酸溶液5ml，摇匀，用上述配制的染料溶液滴定至溶液呈粉红色于15秒不褪色为止计算如下：每毫升染料溶液相当于Vc的毫克数=滴定度(T)=(C×V1)/V2式中：C——抗坏血酸(V)的浓度(mg／m1)Vl——抗坏血酸的量(m1)V2——消耗染料溶液量(m1)(5)0.1N碘酸钾溶液：精确取干燥的碘酸钾0.100ml。0.3567克用水稀释至100ml.(6)0.001N碘酸钾溶液：吸取0.1N碘酸钾溶液1ml，用水稀释至100毫升。此溶液1ml相当于抗坏血酸0.088mg。(7)1％淀粉溶液。(8)6％碘化钾溶液。四、操作方法：1、称取适量(50.0-100.0克)样品，加等量的2％草酸溶液，倒入组织捣碎机中捣成匀浆。称取10.00-30.00克浆状样品(使其含有抗坏血酸1-5mg)，置于小烧杯中，用1％草酸溶液将样品移入100毫升容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。2、将样液过滤，弃去最初毫升滤液。若样液具有颜色，用白陶土(应选择脱色力强但对抗坏血酸无损失的白陶土)去色，然后迅速吸取5-lOml滤液，置于50ml三角烧瓶中，用标定的2.6-二氯靛酚染料溶液滴定之,直至溶液呈粉红色于15秒内不褪色为止。计算：每百克样品中抗坏血酸毫克数＝(V.T)/W×100式中：V——滴定时所耗去染料溶液的量(ml)；T——lml染料溶液相当于抗坏血酸标准溶液的量(mg)W——滴定时所取的滤液中含样品量(g)．五、说明：(1)所有试剂配制最好用重蒸馏水。(2)样品取样后，应浸泡在已知量2％草酸溶液中使抗坏血酸受损失。以免发生氧化，使抗坏血酸受损失。(3)对动性的样品可用10％三氯醋酸代替2％草酸溶液提取；对含有大量Fe的样品，如储藏过久的罐头食品可用8％醋酸

在测定维生素C的国标方法中,荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法,2,4－二硝基苯肼法作为第二法.一,荧光法1.原理样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后,与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量.脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应,以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰.本方法的最小检出限为0.022g/ml.2.适用范围GB12392-90本方法适用于蔬菜,水果及其制品中总抗坏血酸的测定3.仪器3.1.实验室常用设备.3.2.荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计.3.3.打碎机.4.试剂本实验用水均为蒸馏水,试剂不加说明均为分析纯试剂.（1）偏磷酸－乙酸液：称取15g偏磷酸,加入40ml冰乙酸及250ml水,搅拌,放置过夜使之逐渐溶解,加水至500ml.4℃冰箱可保存7～10天.（2）0.15mol/L硫酸：取10ml硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1200ml.（3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液,其余同4.1.配制.（4）50％乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3COONa·3H2O）,加水至1000ml.（5）硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸,溶于100ml乙酸钠溶液（4.4）中.临用前配制.（6）邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺,于临用前用水稀释至100ml.（7）0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝,加0.02mol/L氢氧化钠溶液,在玻璃研钵中研磨至溶解,氢氧化钠的用量约为10.75ml,磨溶后用水稀释至250ml.变色范围：pH=1.2红色pH=2.8黄色pH＞4.0兰色（8）活性炭的活化：加200g炭粉于1L1+9盐酸中,加热回流1~2h,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置于110~120℃烘箱中干燥,备用.（9）标准抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：准确称取50mg抗坏血酸,用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中,并稀释至刻度.抗坏血酸标准使用液（100μg/ml）：取10ml抗坏血酸标准液,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml.定容前试pH值,如其pH＞2.2时,则应用溶液（4.3）稀释.标准曲线的制备：取下述"标准"溶液（抗坏血酸含量10μg/ml）0.5,1.0,1.5和2.0ml标准系列,取双份分别置于10ml带盖试管中,再用水补充至2.0ml.5.操作步骤5.1样品制备全部实验过程应避光.称取100g鲜样,加100g偏磷酸-乙酸溶液,倒入打碎机内打成匀浆,用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度.如呈红色,即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释,若呈黄色或兰色,则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其pH为1.2.匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定.当样品液含量在40~100μg/ml之间,一般取20g匀浆,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml,过滤,滤液备用.5.2氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中,加2g活性炭,用力振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即样品氧化液和标准氧化液,待测定.5.3各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中,分别标明"标准"及"标准空白".5.4各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中,分别标明"样品"及"样品空白".5.5于"标准空白"及"样品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15min,用水稀释至50ml,在4℃冰箱中放置2h,取出备用.5.6于"样品"及"标准"溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液,用水稀释至50ml,备用.5.7荧光反应取"标准空白"溶液,"样品空白"溶液及（5.6）中"样品"溶液各2ml,分别置于10ml带盖试管中.在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺,振摇混合,在室温下反应35min,用激发光波长338nm,发射光波长420nm测定荧光强度.标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标,对应的抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或进行相关计算,其直线回归方程供计算时使用.6.计算X=（c×V/m）×F×(100/1000)式中：X-----样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量,mg/100g；c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度,μg/ml；m-----试样质量,g；F------样品溶液的稀释倍数；V------荧光反应所用试样体积,ml.例：测定每一制备溶液的荧光强度.用标准溶液每ml含2.5μg,5.0μg,7.5μg及10.0μg,各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线.由样品液读数减去样品液空白读数之值,从标准曲线上查得相应的抗坏血酸（μg/ml）,按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量.如：取制备好的辣椒样品2.138g,稀释到100ml,氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml样品读数为23.34,样品空白读数为3.188,样品读数减去样品空白读数为20.152,查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23μg.2.23×10050100-----×-×--=52（mg/100g）2.1381010007.注意事项7.1大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶,因此,抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C.7.2某些果胶含量高的样品不易过滤,可采用抽滤的方法,也可先离心,再取上清液过滤.7.3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸,但它也有吸附抗坏血酸的作用,故活性炭用量应适当与准确,所以,应用天平称量.我们的实验结果证明,用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型,其吸附影响不明显.二,2,4-二硝基苯肼法1.原理总抗坏血酸包括还原型,脱氢型和二酮古乐糖酸.样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎,脎的含量与总抗坏血酸含量成正比,进行比色测定.2.适用范围GB12392-90本方法适用于蔬菜,水果及其制品中总抗坏血酸的测定.3.仪器3.1恒温箱：37±0.5℃3.2可见-紫外分光光度计3.3打碎机4.试剂本实验用水均为蒸馏水,试剂纯度均为分析纯.4.14.5mol/L硫酸：谨慎地加250ml硫酸（比重1.84）于700ml水中,冷却后用水稀释至1000ml.4.285%硫酸：谨慎地加900ml硫酸（比重1.84）于100ml水中.4.32%2,4-二硝基苯肼溶液：溶解2g2,4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸内,过滤.不用时存于冰箱内,每次用前必须过滤.4.42%草酸溶液：溶解20g草酸于700ml水中,稀释至1000ml.4.51%草酸溶液：稀释500ml2%草酸溶液到1000ml.4.61%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500ml1%草酸溶液中.4.72%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中.4.81mol/L盐酸：取100ml盐酸,加入水中,并稀释至1200ml.4.9活性炭：将100g活性炭加到750ml1mol/L盐酸中,回流1~2h,过滤,用水洗数次,至滤液中无铁离子（Fe3+）为止,然后置于110℃烘箱中烘干.4.10标准（1）抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：溶解100mg纯抗坏血酸于100ml1%草酸溶液中.（2）标准曲线绘制加1g活性炭于50ml标准溶液中,摇动1min,过滤.取10ml滤液放入500ml容量瓶中,加5.0g硫脲,用1%草酸溶液稀释至刻度.抗坏血酸浓度为20μg/ml.取5,10,20,25,40,50,60ml稀释液,分别放入7个100ml容量瓶中,用1%硫脲溶液稀释至刻度,使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1,2,4,5,8,10及12μg/ml.按样品测定步骤形成脎并比色.以吸光值为纵坐标,以抗坏血酸浓度（μg/ml）为横坐标绘制标准曲线.5.操作步骤5.1样品制备全部实验过程应避光.5.1.1鲜样制备：称100g鲜样和100g2%草酸溶液,倒入打碎机中打成匀浆,取10-40g匀浆（含1-2mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀.5.1.2干样制备：称1-4g干样（含1-2mg抗坏血酸）放入乳钵内,加入1%草酸溶液磨成匀浆,倒入100ml容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀.5.1.3将上述两液过滤,滤液备用.不易过滤的样品可用离心机沉淀后,倾出上清液,过滤,备用.5.2氧化处理：取25ml上述滤液,加入0.5g活性炭,振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液.取10ml此氧化提取液,加入10ml2%硫脲溶液,混匀.5.3呈色反应5.3.1于三个试管中各加入4ml稀释液.一个试管作为空白,在其余试管中加入1.0ml2%2,4-二硝基苯肼溶液,将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中,保温3h.5.3.23h后取出,除空白管外,将所有试管放入冰水中.空白管取出后使其冷到室温,然后加入1.0ml2%2,4-二硝基苯肼溶液,在室温中放置10~15min后放入冰水内.其余步骤同样品.5.3.385%硫酸处理：当试管放入冰水后,向每一试管中加入5ml85%硫酸,滴加时间至少需要1min,需边加边摇动试管.将试管自冰水中取出,在室温放置30min后比色.5.3.4比色：用1cm比色杯,以空白液调零点,于500nm波长测吸光值.6.计算同荧光法.7.注意事项7.1大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶,因此,抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C.7.2若溶液中含有糖,硫酸加得太快,溶解热会使溶液变黑.7.3试管自冰水中取出后,颜色会继续变深,所以,加入硫酸后30分钟应准时比色.

你好，维生素c的含量是用原子吸收法和分光光度法来测定的。

目前,测定果蔬中的维生素C含量的方法一般采用电位滴定法[2],碘量法[1]等,但所有这些方法都有标准溶液标定繁琐,操作程序复杂,费时等缺点.根据Fe3+使维生素C氧化成脱氢抗坏血酸,脱氢抗坏血酸再与2,4-二硝基苯肼作用生成脎,脎的量与抗坏血酸含量成正比这一原理,采用分光光度法直接测定大枣中的维生素C含量.本方法与传统碘量法测定大枣中的维生素C的含量,结果基本一致,因而本方法结果可靠.另外本方法操作简便,重现性好,克服了碘量法的缺点.